“今天您核酸了没？”
前言
这是「虾写」的第一篇科普向随笔。
由于作者本人对生活中各种乱七八糟的东西都充满好奇，新增这个栏目，一方面是为了把学到的奇怪知识记录下来，另一方面则试图通过讲述给他人听的方式加深自己的理解。
COVID-19 出现后，每年做一两次核酸检测对大多数人来说都已经成了家常便饭，一个非常偶然的机会，我对核酸检测的原理和流程产生了好奇，查阅了一系列资料，并向身边从事生物科学的朋友求证后，最终形成了这篇文章。
一些必要的生物学知识
在详细描述核酸检测原理之前，需要先引入几个最基础的概念。
别担心，这些都是高中生物课本里的知识，任何人都可以看懂。
DNA：脱氧核糖核酸，生物体中的 DNA 几乎从不作为单链存在，而是作为一对彼此紧密相关的双链，彼此交织在一起形成双螺旋结构。组成 DNA 的碱基有4种，分别为腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。
RNA: 核糖核酸，绝大多数的 RNA 为单链结构，RNA 的碱基主要有4种，分别为A（腺嘌呤）、G（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）、U（尿嘧啶）。
cDNA：指互补 DNA，特指在体外经过逆转录后与 RNA 互补的 DNA 链。
而新冠病毒就是一种 RNA 病毒。
采样工作
由于新冠病毒进入人体 96 小时后，会在后咽部的呼吸道上皮细胞中快速复制，所以通常采用鼻拭子或者咽拭子的方式进行采样。
去年我为了看 ChinaJoy 提前一天去做核酸，被人骗到了海军军医大学附属长海医院，那边的护士先是用棉签给我捅了一次喉咙，又换了一根给我做鼻拭子，疼的我差点当场去世。不愧是人民军队的医院，我只花了一份检测的钱，被捅了两次，性价比很高，下次不会再来了。
采样完成后，棉签被放入了存有病毒裂解液的试管中，病毒裂解液可以裂解病毒，并释放出核酸。经过一系列的密封和转运，这些样本就被转移到了实验室里。
检测工作
核酸检测大致可以分为4个步骤，灭活 -> 提取 -> 扩增 -> 检测。
灭活
在这一阶段中，病毒会在56℃的环境中泡半个小时的热水澡（水浴法），这一步的目的是使得病毒在失去生理活性的同时又不影响其基因序列。
提取
经过灭活且静置大约20分钟后，实验室的工作人员便开始进行提取工作了，通常分为手工提取和自动提取，这个取决于检测地点的硬件条件，后者效率比前者要高出不少。
扩增
到这一步，便是重头戏了。
众所周知其实病毒在人体中的含量是很少的，这非常不利于检测工作，所以我们需要一种技术能够在短时间内将其复制百亿倍，这是一个指数级的增长过程，这种技术就叫做「逆转录-聚合酶链式反应」Polymerase Chain Reaction，也就是人们常说的 RT-PCR。
待检测的 RNA 片段 –> cDNA –> 双链 DNA，这就是它大致的一个扩增过程。
扩增这一步到底是怎么做到短时间内（比如1-2小时）就能让核酸序列有指数型的增长呢？我们来看扩增的三个关键步骤：变性、退火和延伸。
变性
DNA双螺旋会在 94℃ （具体温度视需求而定，下同）左右解螺旋变成单链 cDNA，这就是我们的模板。
退火
降低温度，55℃ 左右的时候，引物会以碱基互补配对的原则结合到 cDNA 的两端，所以引物必须是设计好的，能够与 cDNA 两端的一小段序列完美匹配，一般是十几到几十个碱基对的长度。
延伸
提高温度至 72℃ 左右，基础工具准备好了，接下来 DNA 聚合酶会在这个条件下像砌墙工人一样，把碱基对（A T G C）按照A-T、G-C的原则，把砖块们（即体系中游离的碱基对，我们可以称作 dNTP ）在刚才的引物上进行延伸，这样，引物最终会变成和刚才的 cDNA 互补的另一段 DNA 序列。
毫无疑问，每顺利完成一个循环，一条双螺旋 DNA 就会变成两条双螺旋 DNA。
这样的一个循环（变性、退火、延伸）实际上只需要2-4分钟左右，你设置好 PCR 仪之后他就会自动控温反应了。如果你给整个体系 2 小时的反应时间，可想而知原来的核酸序列数量以 2 的几十次方进行增长。
当然我们不需要了解的这么仔细，比如我们最初只有病毒的 RNA 序列，哪里来的双螺旋给我们变性呢？
所以一开始我们的 cDNA 是逆转录酶按照 A-U、G-C 的原则从 RNA 反转录得到的，然后继续进行接下来的循环。
检测
在国内，大多数的核酸检测采用的都是荧光 PCR 检测法。
荧光探针的本质其实是一小段嵌合了发光物质的核苷酸序列，它会针对新冠病毒的两个特异性片段进行结合，当浓度达到一定的阈值后探针就会累积释放出足够仪器检测到的荧光信号，这时也就意味着它在样本中检测到新冠病毒的核酸片段了。
那如何判断是阳性还是阴性呢？
还记得上一步中的扩增么，随着扩增反应的进行，检测到的荧光信号可以绘制成一条曲线，也就是 PCR 扩增曲线。这里需要引入一个叫做 Ct (Cycle Treshold) 值的概念，它代表的是荧光到达设定阈值所进行的循环数。
假设有一小段核酸样本，它经历了35次循环扩增（即2^35）后荧光达到了设定的阈值，那它的 Ct 值为 35。
Ct 值越小，则意味着病毒浓度越高。
根据国家卫健委给出的标准，当 Ct 值小于 37 时为阳性，等于 40 或者无 Ct 曲线则为阴性，若介于 37 与 40 之间则需要重新进行扩增的步骤。
前面我们提到过，荧光探针会针对两个特异性片段进行检测，如果是单一靶标阳性，需要重新采样和检测，只有在检测中两个靶标都为阳性或者两次单一靶标为阳性时，才能被实验室认定为阳性。
这里多说一句，PCR 的指数级增长能够将很少的基因序列放大，这是优点，同时也是致命缺点。你也许经常在新闻报道中听到“假阳性”这个词，没错，这就是 PCR 的致命缺点造成的。
任何小的基因核酸片段，如果在空气中受到了气溶胶污染，经过指数级增长后就会造成假阳性的结果。成千上万的科研人员至今都饱受 PCR 污染的困扰，这也是 PCR 应用受限的原因之一。
值得一提的是，检测通量也是很重要的一个因素。
设想一个样本经历这样数个小时可以完成一次检测，那么中国数亿人要不止一次的进行检测呢？
所以对大样本的处理方法也是非常重要的。我们通常采用混检的方式，比如说十合一混检，就是把每10个样本进行混合，做这样的一次检测，如果结果是阴性，我们可以判定这10个人都是阴性；如果是阳性的话，说明其中有人可能是阳性，再把刚才的这10个样本单独拿出来单检或小批量混检等。
这样的统计学方法可以极大的节省人力物力，毕竟中国的患病率还是很低的，大部分人其实都是阴性，混检可以有效的给大部分阴性居民快速发出“通行证”，而如果全都单检的话工作量就让人难以想象了。
至此，经过各类医务工作者的努力，核酸检测也就完成了。
你的通行证
在最后一步，这些数据会经过汇总，进行一系列的处理后，根据试管上条形码的信息最终汇聚到了各地的健康云上（让我们说：谢谢云计算工程师）。
现在，打开手机，你就能看到你的电子核酸检测报告了。
作者：奥特虾
生物医学顾问：Yu（曾密前男友的大学损友）
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